2結果與分析

2.1 Protamex酶水解對玉米穀蛋白泡沫性質的影響

由圖1可知，經Protamex酶水解的玉米穀蛋白的起泡性和泡沫穩定性均顯著高於原玉米穀蛋白（起泡性（124.46±3.85）%、泡沫穩定性（102.96±3.51）%，P＜0.05），且隨著水解時間延長，呈先增加後減小的變化趨勢。在水解120 min時，水解物的起泡性和泡沫穩定性都為最高，即（350.57±2.83）%和（228.39±2.90）%，分別是原玉米穀蛋白的2.8倍和2.2倍左右。Patino和Ren等水解向日葵蛋白分離物時得到了相似的結果，水解可以提高蛋白質的起泡力和泡沫穩定性，但過度水解對其起泡性和泡沫穩定性產生了不利影響。

圖1水解時間對玉米穀蛋白起泡性及泡沫穩定性的影響

小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

圖2a、b分別為玉米穀蛋白及其水解物經攪打產生泡沫的宏觀和微觀圖像。玉米穀蛋白分散液中懸浮有明顯的大顆粒，產生的泡沫量少且稀疏、形狀不規則，隨放置時間的延長泡沫幾乎消失。微觀形貌顯示玉米穀蛋白膜在泡沫形成10 min時已經發生崩塌。玉米穀蛋白經過Protamex酶水解後，其水解物的溶解性顯著增加（P＜0.05）（表1），因此在泡沫中未見明顯顆粒，泡沫量明顯增加且較為綿密，微觀形貌顯示氣泡數量增多、近似圓形且大小趨於一致、平均氣泡麵積變小，分布致密有序。水解120 min樣品所形成的泡沫最細小均勻，且在泡沫形成後的30 min內，與其他水解時間的樣品相比，其氣泡數量最多，平均氣泡麵積最小，蛋白膜的厚度較厚。有報道稱平均氣泡麵積越小，分布越均勻致密越有利於其穩定。但隨著酶解時間的延長，水解物的起泡性和泡沫穩定性都顯著降低（P＜0.05）。蛋白質的起泡性與蛋白質溶解性、分子尺寸、疏水性和分子柔性等性質有關，泡沫穩定性則由蛋白質的黏度、膜的厚度、分子間相互作用等性質決定。因此，通過對以上性質的研究解析水解後玉米穀蛋白起泡性和泡沫穩定性的變化原因。

表1水解時間對玉米穀蛋白溶解性、水解度、表麵張力和表麵疏水性的影響

注：同列肩標小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

圖2不同水解時間玉米穀蛋白泡沫的宏觀圖像（a）和微觀圖像（b）

2.2 Protamex酶水解對玉米穀蛋白溶解性和表麵張力的影響

由表1可知，原玉米穀蛋白的溶解性僅為（20.90±0.17）%，經Protamex酶水解後，水解物的溶解性顯著提高，在水解60 min後均可達到90%以上。這說明Protamex酶水解能夠改善穀蛋白的溶解性，其水解物中蛋白質/多肽能夠更好地分散在水中，形成膠體態溶液。研究過程中發現水解物分散液並非透明澄清的溶液，而是可以看到少量膠體物質懸浮於溶液中，並且在溶解性測定方法的離心力下，這些懸浮的蛋白質也不能夠完全被沉澱，而是較穩定的存在於上清液中。當蛋白質溶液被攪打時，隻有分散在溶液中的蛋白質才能夠快速在氣/水界麵吸附。因此，水解物溶解性的提高使可以吸附到氣/水界麵上的蛋白質含量增加，這對玉米穀蛋白起泡力的改善具有積極意義。隨著水解時間的延長，玉米穀蛋白的水解度在反應前30 min中快速增加，之後持續升高並在120 min後趨於平穩，所有水解物的蛋白質含量在74%～85%之間。原玉米穀蛋白的表麵張力為（71.83±0.50）mN/m，經Protamex酶水解後，其水解物的表麵張力均顯著降低，且隨水解時間的延長呈先降低後升高趨勢。當水解時間在120 min時表麵張力達最低（60.40±0.72）mN/m，這與其起泡性的變化趨勢一致。這是由於適度的水解有利於增強蛋白質的分子柔性，暴露出更多疏水基團，更有利於水解物中蛋白質/多肽的疏水性基團和親水性基團分別伸展至氣相和水相，從而在界麵處發生吸附，導致表麵張力的降低。表麵張力反映蛋白質分子在氣/水界麵的吸附和展開的速度。表麵張力越低，蛋白能夠越快速的完成在氣水界麵上的吸附，形成有一定黏彈性的保護層，促進泡沫的形成以及維持泡沫體係的穩定。過度的水解使蛋白質分子持續減小，低分子質量多肽由於肽段過短而失去分子柔性，不能在界麵處發生吸附，導致水解時間為150 min水解物的表麵張力增加。

2.3 Protamex酶水解對玉米穀蛋白粒徑分布及Zeta電位的影響

蛋白質受到酶和熱的作用，使得蛋白質分子發生解離和聚集的動態變化，通過測量粒徑及Zeta電位可對其水解過程中蛋白質分子大小、聚集和靜電相互作用情況進行表征。由圖3a可知，玉米穀蛋白的粒徑分布圖中出現3個明顯粒徑峰，P1（＜68 nm）、P2（68～825、900 nm）和P3（＞3 000 nm）。隨著Protamex酶水解時間的延長，水解物的粒徑逐漸向小粒徑方向移動，其中P2峰逐漸向左移動與P1峰重合，在水解60 min後的酶解物中P1峰完全消失，同時粒徑較大的P3峰也在水解60 min後消失。這說明著Protamex酶水解作用不僅使玉米穀蛋白的粒徑降低，同時使粒徑均一度增加。由圖3b可知，水解30 min後酶解物平均粒徑顯著降低（P＜0.05），並隨著水解時間延長而持續降低。這可能是由於水解作用切斷了玉米穀蛋白分子內肽鍵，大分子質量聚集體發生降解，低分子質量二聚體/亞基或者多肽逐步釋放，使粒徑降低。而水解反應過程中水熱環境的作用可能引起暴露巰基的氧化交聯等共價作用使部分蛋白質/多肽發生聚集，因此水解60 min和120 min樣品的平均粒徑差異不顯著（P＞0.05）。楊曉釩等在酶水解處理扁桃仁蛋白質的研究中也發現了水解時間超過60 min後，水解物的粒徑反而逐漸增大。值得注意的是，本研究采用馬爾文納米激光粒度儀測定的樣品粒徑為納米級別，對玉米穀蛋白中部分粒徑較大的大分子質量天然聚集體未能測出。

圖3水解時間對玉米穀蛋白的粒徑分布（a）和平均粒徑及Zeta電位（b）的影響

由圖3b可以看出，與原穀蛋白相比，Protamex酶水解物的Zeta電位絕對值顯著降低（P＜0.05），在水解120 min時達到最低，為（16.30±0.50）mV，而酶解150 min時回升至（19.47±0.31）mV。玉米穀蛋白的Zeta電位為負值，說明其分子表麵帶有負電荷，絕對值降低說明了水解蛋白質分子表麵淨電荷減少。這是由於水解過程中脫氨基作用和帶正電荷氨基酸暴露，使得蛋白質/多肽所帶正電荷增加，從而中和部分負電荷所致。當水解時間延長至150 min，可能是由於反應進程中蛋白質/多肽的解聚與聚集動態變化導致部分帶正電荷氨基酸重新被包埋而使絕對值增加，也可能是帶負電荷氨基酸暴露增加所致。表麵淨電荷的減少對蛋白質/多肽在膜界麵的吸附和擴散有利，促進泡沫的形成。同時還能夠降低它們在界麵的靜電斥力，有利於形成黏彈性較好的界麵膜而增強泡沫穩定性。Xiong Wenfei等研究也指出較小的粒徑與表麵電荷可加速蛋白質分子的擴散速度，提升其在氣/水界麵的吸附速率，並有利於蛋白質分子在界麵上的展開和重排，從而提高起泡性。

2.4 Protamex酶水解對玉米穀蛋白內源熒光光譜的影響

玉米穀蛋白中的芳香族氨基酸，即苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基在激發波長290 nm處可產生熒光，即內源性熒光。內源熒光光譜變化反映了穀蛋白及其水解物中芳香族氨基酸所處的微環境極性的變化情況，是對Protamex酶水解過程中蛋白質三級結構變化的表征。由圖4可知，與原玉米穀蛋白相比，Protamex酶水解物的內源性熒光光譜峰位發生明顯的紅移現象，且內源性熒光強度水解時間的延長而顯著增強。這表明水解使玉米穀蛋白的芳香族氨基酸特別是色氨酸的極性環境增強，蛋白質結構伸展。Zheng Zhaojun等通過Bromelain和Alcalase分別水解黑豆蛋白時也獲得了相似結果，水解產物的熒光強度均高於原蛋白樣品。Protamex屬於絲氨酸蛋白酶，酶水解過程中以絲氨酸殘基作為活性中心主要促使玉米穀蛋白中酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸等的羧基端多肽鏈裂解，導致芳香族氨基酸殘基和疏水性氨基酸的暴露，增強了玉米穀蛋白的分子柔性，這有利於玉米穀蛋白質能發揮良好的起泡力和泡沫穩定性。但是在水解150 min盡管有更多的芳香族氨基酸殘基暴露，卻不能使水解物的起泡力和泡沫穩定性持續增加，這是因為影響玉米穀蛋白水解物起泡性質變化是多種因素相互作用的結果。

圖4水解時間對玉米穀蛋白內源熒光強度的影響