1.4生物表麵活性劑的提取、鑒定和臨界膠束濃度測定

取培養72 h的細菌發酵液在4℃、5000×g離心30 min，取上清液用1 mol·L-1HCl調節pH為2.0，然後加入等體積的三氯甲烷/甲醇（2∶1，V∶V）混勻，萃取三次合並有機相，用無水硫酸鈉幹燥後，45℃旋轉蒸發除去有機溶劑，得到淺黃色漿狀物，即為生物表麵活性劑粗產物。

薄層色譜：取0.2 g提取的上述粗產物溶於1 mL的氯仿中，點樣於矽膠G板進行薄層色譜分析，三氯甲烷/甲醇/水（65∶15∶1，V∶V）為展開劑，用不同的顯色劑顯色。（1）苯酚-硫酸試劑：3 g苯酚與5 mL硫酸溶解於95 mL乙醇中，如果顯棕色斑點，則有糖脂存在，反之糖脂不存在；（2）茚三酮顯色劑：0.5 g茚三酮溶於100 mL丙酮中，如果斑點顯紅色，則有脂肽存在，反之脂肽不存在。

紅外掃描分析（Fouriertransforminfraredspectrometer，FT-IR）：將生物表麵活性劑粗產品溶於三氯甲烷後，在製備型矽膠薄板上進行分離，依照顯色帶位置刮下目的矽膠層，用三氯甲烷/甲烷（1∶1，V∶V）提取後於40℃下減壓蒸幹，得到部分純化的生物表麵活性劑。將上述生物表麵活性劑溶於甲醇，采用KBr壓片法（1～2 mg樣品+200 mgKBr，幹燥處理後研細），混合壓成透明薄片後紅外掃描分析測定。

發酵產物臨界膠束濃度測定（Critical micelle concentration，CMC）：精確稱取上述提取所得的產物粗品溶於蒸餾水中，配製成不同濃度梯度（0～500 mg·L-1）的產物溶液，測定溶液的表麵張力，並依據表麵活性劑濃度-表麵張力曲線求得臨界膠束濃度值。

1.5細菌發酵條件優化

1.5.1測定指標

發酵液表麵張力值以吊環法測定，乳化性能采用超聲體積比法測定。發酵液培養後，離心收集菌體，於105℃烘幹至恒重後稱重，以菌體幹重表示生物量。發酵液培養後，離心收集上清液，用等體積乙酸乙酯萃取2次後，45℃減壓蒸幹，將殘餘物溶於等體積的0.05 mol·L-1NaHCO3中，以硫酸苯酚法測定糖脂含量。

1.5.2碳源對菌株生長及產生表麵活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL無機鹽培養基，分別加入10 g·L-1的葡萄糖、甘油、花生油、可溶性澱粉、液體石蠟、麥芽糖、乳糖、蔗糖（對照組不加碳源）。3 d後分別測定發酵液的表麵張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重複。

1.5.3氮源對菌株生長及產生表麵活性劑的影響

以碳源實驗中獲得的最優碳源作為選定碳源，取10 g碳源加入1 L不含（NH4）2SO4無機鹽培養基中。取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述培養基，分別加入2 g·L-1的硝酸鈉、硫酸銨、脲、硝酸銨（對照組不加氮源）。3 d後分別測定發酵液的表麵張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重複。

1.5.4碳氮比對菌株生長及產生表麵活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL含不同碳氮源的無機鹽培養基。固定氮源為2 g·L-1，分別加入已優化的碳源，控製比例為1、5、10、15、20、25、30、35、40（對照組不加氮源）。3 d後分別測定發酵液的表麵張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重複。

1.5.5溫度對菌株生長及產生表麵活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優化的無機鹽培養基。控製搖床溫度在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。3 d後分別測定發酵液的表麵張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重複。

1.5.6 pH對菌株生長及產生表麵活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優化的無機鹽培養基。控製培養基pH為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。3 d後分別測定發酵液的表麵張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重複。

1.5.7NaCl濃度對菌株生長及產生表麵活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優化的無機鹽培養基。控製培養基NaCl濃度為0、5、10、15、20、25、30、50、80、120、160 g·L-1。3 d後分別測定發酵液的表麵張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重複。

1.5.8菌株147發酵動態圖

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優化的無機鹽培養基。在12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144 h後分別測定發酵液的表麵張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個處理三次重複。

1.6生物表麵活性劑對多環芳烴增溶效果

25 mL三角瓶中加入過量的苯並［a］芘、芘、熒蒽和10 mL不同濃度的生物表麵活性劑粗產物溶液，然後加入0.02%的疊氮化鈉抑製微生物的生長。蓋好塞子並用封口膜封口後，25℃、50 r·min-1振蕩48 h後，將溶液轉移至離心管中5000 r·min-1離心15 min，取上清液加入等體積的二氯甲烷∶正己烷=1∶1（V∶V）萃取3次，收集洗脫液並於40℃濃縮至幹，用甲醇定容到2 mL，過0.22μm孔徑濾膜後HPLC分析。